Иммунохимические методы исследования кала

Заболевания желудочно-кишечного тракта актуальная проблема медицины. На сегодняшний день предусмотрено множество способов их диагностики и всегда есть анализы, которые могут выявить заболевания и их показатели на ранних этапах развития. Однако современная медицина имеет тенденцию развиваться в направлении замены инвазивных методов на малоинвазивные или неинвазивные.

Неинвазивные методы лабораторной диагностики основаны на изучении биологического материала, который выделяется организмом естественным путем (моча, кал, слюна, пот и др.).

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека состоит из нескольких частей. Он включает ротовую полость, пищевод, желудок, 12-перстную кишку, тонкий кишечник, толстый кишечник и прямую кишку. В полость кишечника выделяется желчь и сок поджелудочной железы. Заболевания желудочно-кишечного тракта можно классифицировать как воспалительные, язвенные, опухолевые (доброкачественные и злокачественные), паразитарные. При всех заболеваниях в просвете желудка и/или кишечника могут образовываться и/или накапливаться различные вещества, характерные для того или иного заболевания, которые в конечном итоге выделяются с калом. Использование современных чувствительных методов, многие из которых появились в последние годы, позволяет по анализу кала неинвазивным, доступным и необременительным для любого пациента способом выявить ряд заболеваний или инфекционных агентов, вызывающих заболевания.

В последнее время в арсенале лаборатории появились новые чувствительные и информативные методы, основанные на исследовании кала, которые позволяют выявить ряд заболеваний с высокой степенью надежности. Можно выделить основные маркёры заболеваний желудочно-кишечного тракта: кальпротектин, лактоферрин, альбумин, р- дефензин, комплекс гемоглобин- гаптоглобин, миелопероксидаза, эластаза, лизоцим, панкреатическая эластаза, эозинофильный нейротоксин.

Кальпротектин является продуктом нейтрофильных гранулоцитов. Среди них лактоферрин и кальпротектин наиболее стабильны и медленно разлагаются протеазами микроорганизмов, что позволяет использовать в диагностических целях исследование их концентрации в кале. Данные белки относят к биомаркерам «фекального воспаления».

Кальпротектин – белок с молекулярным весом 36 kDa, содержащий в своем составе ионы кальция и цинка и обладающий бактериостатическим и фунгицидным действием in vitro. Он составляет 60% белка, содержащегося в цитоплазме нейтрофилов, в низкой концентрации может быть обнаружен в моноцитах и тканевых макрофагах. Синтез кальпротектина в кале отражает приток нейтрофилов в просвет кишки. Кровотечение из стенки кишки незначительно отражается на концентрации кальпротектина в стуле и увеличивает его концентрацию не более чем на 10 мкг/г. Повышение концентрации фекального кальпротектина более 120 мкг/г отмечают более чем у 90% больных с воспалительными заболеваниями кишечника на этапе первичной диагностики.

Выявление фекального кальпротектина позволяет дифференцировать больных с синдромом раздраженной толстой кишки от больных с органическими причинами поражения желудочно-кишечного тракта. Умеренно повышенные значения кальпротектина наблюдают при поражении слизистой (в том числе при целиакии, лактазной недостаточности, аутоиммунном гастрите), значительно повышенные концентрации отмечаются при воспалительных заболеваниях кишечника, бактериальных инфекциях желудочно-кишечного тракта, дивертикулах и онкологических заболеваниях, постоянном приеме нестероидных противовоспалительных средств (НПВС).

В период новорожденности, а также у детей младшего возраста, концентрация кальпротектина в среднем выше, чем у взрослых. В связи с низкой специфичностью, фекальный кальпротектин не может заменить инструментальные методы диагностики болезни Крона. Гистологическое исследование является «золотым стандартом» диагностики, комбинация эндоскопических визуализационных методов позволяет уточнить локализацию участков и объем поражения кишечника. Преимуществом исследования фекального кальпротектина при болезни Крона является то, что его повышенная концентрация может отражать сегментарные поражения тонкой кишки, которая недоступна для эндоскопического и/или гисотологического исследований. Поскольку концентрация фекального кальпротектина в стуле непосредственно коррелирует с гистологической и эндоскопической активностью заболевания, стойко повышенный уровень фекального кальпротектина может указывать на неэффективность терапии, а повышение содержания кальпротектина в динамике наблюдения - на вероятность обострения заболевания.

В ранней диагностике заболеваний кишечника исследование фекального кальпротектина и исследование кала на скрытую кровь у пациентов со специфическими жалобами помогают подтвердить необходимость проведения колоноскопии.

Что означают результаты?

Референсные значения: < 50 мкг/г.

Если уровень кальпротектина в кале пациента находится в пределах референсных значений, значит, у него отсутствуют воспалительные заболевания кишечника.

Умеренное повышение уровня кальпротектина требует дальнейшего наблюдения пациента и выполнения исследования в динамике.
Сильное повышение (с учетом клинической картины) свидетельствует о том, что пациент страдает воспалительным заболеванием кишечника, поэтому требуется целенаправленное обследование и специфическая терапия. Также оно может быть следствием следующих патологических состояний: бактериальных и вирусных инфекций ЖКТ (сальмонеллез, кампилобактериоз, аденовирусы, ротавирусы, норовирусы), новообразований кишечника, дивертикулов, муковисцидоза, аллергии к коровьему молоку, целиакии, кишечного кровотечения.

Лактоферрин –полифункциональный белок из семейства трансферринов. Лактоферрин является глобулярным гликопротеином с молекулярной массой около 80 кДа и широко представлен в различных секреторных жидкостях, таких как молоко, слюна, слезы, секреты носовых желез.

Лактоферрин относится к системе врожденного иммунитета. Существуют данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка — это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномоделирующим действиями и радиопротективными свойствами.

Антибактериальная активность. Антибактериальные свойства белка обусловлены способностью лактоферрина связывать железо и тем самым лишать бактериальную микрофлору необходимого для ее роста и жизнедеятельности микроэлемента. Вместе с тем в основе антиинфекционной активности лактоферрина могут лежать механизмы, не зависящие от способности белка связывать ионы железа, например стимулирующее действие лактоферрина на фагоцитоз и влияние на активность комплемента. (специфическое взаимодействие лактоферрина с наружной бактериальной мембраной, которое приводит к гибели клеток бактерий). Было показано, что белок разрушает бактериальную мембрану и даже проникает внутрь клетки. За специфическое связывание с бактериальной стенкой ответственен лактоферрицин — пептид, расположенный на N-конце молекулы лактоферрина и получаемый in vitro протеолитическим расщеплением белка трипсином.

Антивирусная активность. Показано, что лактоферрин обладает антивирусной активностью против широкого спектра вирусов человека и животных с ДНК и РНК геномами. Лактоферрин связывает различные антигены вирусной природы преимущественно в условиях in vitro. На данный момент показано действие белка против вирусов простого герпеса 1 и 2, цитомегаловируса, ВИЧ, вируса гепатита С, ротавирусов, полиовирусов первого типа, аденовирусов,респираторного синцитиального вируса.

Показано, что лактоферрин и лактоферрицин ингибируют in vitro рост Trichophyton mentagrophytes, который вызывает ряд кожных заболеваний, например, стригущий лишай. Лактоферрин обладает активностью против Candida albicans -- симбионтов, образующих колонии в слизистой оболочке ротовой полости здоровых людей. Лактоферрин также изучается как маркёр бактериальной воспалительной диареи у пациентов, которая вызвана, например Shigella, Salmonella, Campylobacter и Clostridium difficile.

При болезни Крона концентрация фекального лактоферрина возрастает в десятки и сотни раз, значительно повышается в кале и уровень кальпротектина. Поэтому тест является очень чувствительным и специфичным при данной патологии.

Анализ кальпротектин, лактоферрин в кале

используется и для динамического наблюдения пациентов с уже установленным диагнозом (НЯК, БК) с целью:
определения эффективности терапии;
динамического контроля и оценки фазы ремиссии или рецидива;
выявления рецидива заболевания;
оценки побочного действия лекарств, повреждающих слизистую кишечника и подбора лекарственных препаратов, хорошо переносимых пациентом.

Показания к назначению анализа кальпротектин и лактоферрин в кале:

диагностика воспалительных заболеваний кишечника;
дифференциальная диагностика органических (воспалительных) заболеваний кишечной стенки и функциональных расстройств (СРК);
мониторинг течения заболевания и эффективности терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите (НЯК);
совместно с исследованием кала FOB+Transferrin (анализ на скрытую кровь в кале) отбор пациентов для проведения колоноскопии;
энтеропатия, связанная с приёмом нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП).

АЛЬБУМИН

Альбумин является основным белком человеческой плазмы (40-60%), синтезируется печенью в зависимости от поступления белка. Наличие альбумина в кале отражает воспалительную реакцию и кишечное кровотечение.

Повышенное содержание альбумина и гемоглобина в кале находят не только при колоректальных карциномах, но также у пациентов с полипами и хроническими воспалительными заболеваниями (болезнью Крона или язвенным колитом).

Показания:

установление источника кровотечения в нижних отделах желудочно-кишечного тракта;
диагностика колоректальной карциномы;
обследование пациентов группы риска;
болезнь Крона;
язвенный колит.

ЭОЗИНОФИЛЬНЫЙ НЕЙРОТОКСИН (EOSINOPHIL-DERIVEDNEUROTOXIN, EDN)

EDN — катионный гликопротеин, который секретируется активированными эозинофилами, обладает сильной цитотоксичностью и имеет большое значение в противовирусной защите. Он высвобождается из эозинофильных гранул в местах скопления эозинофилов: коже, легких, слизистых оболочках урогенитальной системы и желудочно- кишечного тракта, т. е. в месте встречи организма с патогеном. Аккумуляция EDN в кишечнике связана с повреждением тканей. EDN также помогает определить целостность слизистой кишечника при воспалительных заболеваниях, карциноме кишечника, кишечных паразитозах. Так же для диагностики дифференциации между пищевой аллергией и пищевой непереносимостью и оценки эффективности элиминационной диеты рекомендуют измерять содержание эозинофильного нейротоксина рибонуклеаза ЕРХ в кале.

Тест EDN в кале может служить объективным параметром текущего клинического или субклинического хронического воспаления в желудочно-кишечном тракте. У больных с язвенным колитом и болезнью Крона уровень EDN позволяет судить об активности и прогнозе заболевания.

Р-ДЕФЕНЗИН-2

р-Дефензины являются частью врожденного иммунитета и антимикробного иммунного барьера слизистой кишечника. Дефензины обладают антимикробной активностью в разной степени против бактерий, грибков и некоторых оболочечных вирусов.

Дефицит р-дефензина-2 может наблюдаться в слизистой кишечника у пациентов с болезнью Крона. Система дефензинов у таких больных неполноценна и не ограничивает инвазивный бактериальный рост, приводящий к типичным для болезни Крона инфекциям. Роль недостаточности р-дефензина-2 в патогенезе болезни Крона в настоящее время изучается. Также возможно, что некоторые пробиотические бактерии про-дуцируют р-дефензин.

Показание:

дифференциальная диагностика болезни Крона (снижение уровня р-дефензина-2) и язвенного колита (повышение уровня р-дефензина).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНА Н. PYLORI

Helicobacter pylori считается причиной хронического гастрита В, нелекарственного язвенного дуоденита и этиологическим стимулом MALT-лимфомы желудка. Кроме того, предполагают его участие в патогенезе карциномы желудка. В западных индустриально развитых странах эпидемиология геликобактерной инфекции характеризуется линейным ростом с возрастом, а в развивающихся странах вовлечено также большое количество детей и подростков. Существующие методы инфекции Helicobacter pylori чувствительны и высокоспецифичны, но требуют либо инвазивных образцов, либо специального оборудования. Данный метод разработан для неинвазивной диагностики инфекции Н. pylori в образцах кала и обеспечивает надежные результаты без потери чувствительности и специфичности. Тест имеет эквивалентные с уреазным дыхательным тестом чувствительность и специфичность.

Показания:

диагностика инфекции Helicobacter pylori;
контроль эффективности антигеликобактерной терапии.

КОМПЛЕКС «ГЕМОГЛОБИН-ГАПТОГЛОБИН» (НЬ-Нр) В КАЛЕ

Свободный НЬ немедленно комплексируется с сывороточным белком гаптоглобином (Нр). Комплекс НЬ-Нр более стабилен в кишечнике по сравнению с НЬ. С помощью комбинации двух методов можно определить даже кровотечение из аденоматозных узлов/карциномы верхнего отдела гастроинтестинального тракта. Сочетание двух методов высокочувствительно для раннего обнаружения колоректальной карциномы. В отличие от других тестов определения крови в кале, этот метод не требует диетических или лекарственных ограничений, способствует определению FHb с чувствительностью, превосходящей экспресс-тесты в 100 раз, что позволяет исключить ложноотрицательные результаты. Подобранные антитела обеспечивают высокую специфичность. На результаты не влияют гемоглобин животных, миоглобин, пероксидазы животных и растений или антиоксиданты, подобные витамину С. Метод доступен в иммуноферментном и экспресс-формате.

Показания:

анализ на скрытую кровь в кале;
болезнь Крона, язвенный колит;
подозрение на карциному толстого кишечника;
полипы прямой кишки.

МИЕЛОПЕРОКСИДАЗА

Гранулы нейтрофилов содержат большое количество разных ферментов. Миелопероксидаза катализирует окисление с образованием токсичных для микро-организмов перекисных продуктов. Эффективность разрушающего бактерии действия усиливается под действием эластазы полиморфноядерных лейкоцитов. Определение миелопероксидазы в кале отражает активность болезни Крона и язвенного колита.

Показания:

маркер воспаления желудочно-кишечного тракта;
окислительный стресс.

ЭЛАСТАЗА ПОЛИМОРФНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ

Эластаза азурофильных гранул нейтрофилов, гликопротеин из группы сериновых протеаз. Маркер воспалительных заболеваний, может вызвать серьезные поражения ткани в месте секреции. Особенно это важно для болезни Крона, характеризующейся ростом фагоцитарной активности и повышенной секрецией эластазы полиморфнонуклеарной и других лизосомальных ферментов.

Показания:

маркер активации болезни Крона;
бактериальная инфекция;
дифференциальная диагностика болезни Крона и синдрома раздраженного кишечника.

ХИМОТРИПСИН

Химотрипсин — фермент сериновая протеаза, которая секретируется поджелудочной железой после приема пищи. Белки пищи гидролитически расщепляются химотрипсином. Незначительная часть активного фермента экскретируется с калом. В случае недостаточности поджелудочной железы секреция фермента значительно снижена. Анализ химотрипсина в кале — информативный неинвазивный параметр для оценки нарушений панкреатической функции. Преимущество данного метода в том, что с его помощью измеряют именно концентрацию, а не активность фермента. Химотрипсин характеризуется высокой стабильностью (12 дней при комнатной температуре), что сравнимо с устойчивостью панкреатической эластазы, поэтому определение химотрипсина в кале является альтернативным для теста панкреатической эластазы.

Показания:

хронический панкреатит;
экзокринная недостаточность поджелудочной железы.

ПАНКРЕАТИЧЕСКАЯ ЭЛАСТАЗА-1

Эластаза-1 — протеолитический фермент, синтезируемый исключительно поджелудочной железой. Для нее характерны стабильность в кишечном пассаже и даже аккумуляция: концентрация эластазы в 6 раз выше в кале по сравнению с дуоденальным соком. Определение концентрации энзима отражает секреторную способность экзокринной ткани поджелудочной железы. Этот метод видоспецифичен и не имеет перекрестных реакций со свиным ферментом, поэтому пациентам не нужно прерывать лечение ферментными препаратами для исследования.

Показание — диагностика экзокринной недостаточности поджелудочной железы:

при хронических панкреатитах;
муковисцидозе;
карциноме поджелудочной железы;
инсулинзависимом сахарном диабете;
синдроме Швахмана-Даймонда;
панкреатической недостаточности другого происхождения.

ЛИЗОЦИМ

Лизоцим (мурамидаза) — белок с молекулярной массой около 15 кДа, принадлежащий к группе щелочных гликозидаз. Лизоцим продуцируется гранулоцитами, моноцитами и макрофагами. Основной источник лизоцима в кале — интестинальные гранулоциты. Он может определяться в воспалительном инфильтрате в острый период болезни Крона. Также он активно секретируется мононуклеарами в просвет кишки.

Показания:

диагностика и мониторинг болезни Крона;
бактериальные, вирусные, аллергические и аутоиммунные воспалительные заболевания кишечника.

А1 - АНТИТРИПСИН

А1 - Антитрипсин действует как первичный ингибитор эластазы полиморфно-ядерных нейтрофильных гранулоцитов (PMN-эластазы) и секретируется во время воспаления, снижая протеолитическую активность PMN-эластазы в месте воспаления. Кроме того, через образование комплекса ингибирует группу сериновых протеаз, участвующих в образовании сгустка, трипсина, химотрипсина и т. п. Таким образом, а1-антитрипсин играет важную регуляторную роль в антивоспалительном ответе. А1-Антитрипсин — линейный гликопротеин с молекулярной массой 52 кДа (394 аминокислотных остатка), со свободным цистеиновым остатком и тремя боковыми углеводными цепями. Синтезируется преимущественно в печени, а также макрофагами, моноцитами и эпителиальными клетками слизистой оболочки кишечника. А1-Антитрипсин является основным ингибитором сериновых протеаз в плазме человека. Также доказано, что фекальный а1-антитрипсин — важный маркер интестинальной потери белка и повышенной проницаемости кишечника, так как он устойчив к деградации в кишечнике за счет своей антипротеолитической активности. Кроме того, измерение концентрации фекального а1-антитрипсина используют для оценки и мониторинга хронических воспалительных заболеваний кишечника. В клинической практике оценка клиренса а1-антитрипсина (соотношение уровней а1-антитрипсина в кале и крови) предпочтительнее по сравнению с единственным определением в кале: ложнонегативные и ложноположительные результаты снижаются на 21%. Метод более чувствителен по сравнению с рутинными методами и способствует определению концентрации белка в супернатантах клеточных культур, а также успешному распознаванию как печеночной, так и кишечной формы а1-антитрипсина. Данный метод — перспективная альтернатива методу радиальной иммунодиффузии, особенно при большой потере белка. Комбинация двух типов специфических антител снижает количество ложнонегативных результатов, гарантируя надежную диагностику. Таким образом, это новый, простой в использовании и неинвазивный тест для определения интестинальной потери белка.

Показания:

синдром потери белка через кишечник и нарушение интестинальной проницаемости;
болезнь Крона;
некротический энтероколит;
воспаление вирусного, бактериального или аллергического происхождения.

Выводы: "Золотым стандартом" обследования на заболевания желудочно - кишечного тракта являются инвазивные (от латинского invasio — внедрение) методы, которые основаны на получении биологического материала путем его отбора после проникновения внутрь жидких сред (кровь и другие) и тканей организма. Инвазивные методы дают высокую точность диагностики. Примечательно, что исследование белков, обнаружение которых в кале указывает на воспалительные и невоспалительные заболевания ЖКТ является неинвазивным методом динамического наблюдения пациентов и позволяет уменьшить количество инвазивных исследований.

Список исследованной литературы

Статья медицинской энциклопедии http://meddaily.info/.
Статья лабораторной службы Хеликс.http://www.helix.ru/kb/
Н.В. Филипенко: Неинвазивная диагностика колороректального рака и язвенного колита на основе комбинированного использования фекального лактоферрина и иммунохимического теста на скрытую кровь в кале
Цимбалова, А.Г. Кучеренко, М.М. Лохматов Научный центр здоровья детей РАМН, Москва Фекальныйкальпротектинв неинвазивной диагностике воспалительных заболеваний кишечника у детей
Сагынбаева В. Э., Лазебник Л. Б. Сывороточный кальпротектин является маркёром для определения активности воспалительного процесса и эффективности терапии при воспалительных заболеваниях кишечника. ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова»
Будзак И. Я. Дифференциальная диагностика воспалительных и функциональных заболеваний кишечника.
Н.С. Рытикова Фекальныйкальпротектин– неинвазивный маркер нейтрофильного интестинального воспаления.
Ильяшенко М. Г., Тарасова Г. Н., Бурцев Д. В Клиническая информативность содержания альфаи бета-дефензиновв биологических средах у больных язвенным колитом
Шелыгин Ю.А., Чернышов С.В., Веселов А.В. Современные скрининговые методы бессимптомного колоректального рака и предраковых заболеваний толстой кишки
Осипенко М.Ф., Венжина Ю. Ю., Жук Е.А.Характеристика относительной внешнесекреторной недостаточности поджелудочной железы
Лазебник Л. Б., Гусейн-заде М. Г., Ефремов Л. И..Фекальный кальпротектин как биомаркер эффективности различных медицинских вмешательств у больных воспалительными заболеваниями кишечника